高效篩選方法的前提在于建立可靠的基因型和表型的關(guān)聯(lián),這涉及兩個(gè)層面:首先符合預(yù)期表型的突變體的基因型可被回溯,即建立氨基酸序列和基因信息之間的聯(lián)系;其次,突變體相比于親本的表型變化能被設(shè)備或肉眼捕捉,最好能夠量化展示突變體性能提升的程度。
突變體的遺傳物質(zhì)和蛋白存在物理聯(lián)系的關(guān)鍵在于將二者鎖定在固定的空間內(nèi),酶反應(yīng)引起的物化性質(zhì)變化作為篩選的依據(jù),同一空間內(nèi)的遺傳物質(zhì)則作為突變體酶的分子標(biāo)簽。體內(nèi)篩選所用的微生物細(xì)胞是天然存在的最理想的物理空間,符合期望的表型能直接回溯到相應(yīng)基因型,并直接獲得可持續(xù)繁殖的個(gè)體。CSR、FADS技術(shù)中的微液滴則是在細(xì)胞外再構(gòu)造了一層物理屏障,確保細(xì)胞破碎后其DNA和蛋白依然共存。而對于以無細(xì)胞反應(yīng)系統(tǒng)為基礎(chǔ)的液滴篩選技術(shù)(圖1),缺少了微生物這個(gè)“內(nèi)包裝”,均相溶液中核酸(mRNA或DNA)和蛋白則只能依賴分子間的相互作用而直接偶聯(lián)(如依賴嘌呤霉素和嘌呤霉素連接子建立聯(lián)系),形成類似mRNA-核糖體-蛋白三元復(fù)合物的結(jié)構(gòu),確保酶和相應(yīng)的核酸一一對應(yīng)。
另一類方式則是將突變體單克隆預(yù)先備份,突變體酶性能評價(jià)結(jié)束后通過試管編號回溯到相應(yīng)的種子液,進(jìn)行再培養(yǎng)和后續(xù)測試。而在液滴技術(shù)領(lǐng)域,隨著設(shè)備準(zhǔn)確度、速度、智能化程度的提升,液滴編碼標(biāo)記和單液滴分離技術(shù)也將可以實(shí)現(xiàn)FADS系統(tǒng)中的液滴的備份。
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圖1. 酶反應(yīng)過程監(jiān)測
(圖片來自:doi: 10.1016/j.tibtech.2020.01.001)
高效檢測讓篩選事半功倍!
酶的種類千差萬別,不同酶又有多樣化的性能提升需求,因此定向進(jìn)化篩選的標(biāo)準(zhǔn)是需要精確、客觀、容易量化的,最重要的是性能變化能直接或間接地被鑒別。
在體內(nèi)篩選系統(tǒng)中,參與轉(zhuǎn)錄和翻譯過程的酶蛋白的性能變化能夠轉(zhuǎn)化為報(bào)告基因的水平差異,如涉及轉(zhuǎn)錄的甲基化酶、RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄因子(圖1c1)、調(diào)控因子,涉及翻譯的核酶、tRNA及tRNA合成酶。此外,一些轉(zhuǎn)錄因子需要與特定的代謝中間產(chǎn)物協(xié)同作用(如LacZ和半乳糖、AraC和阿拉伯糖),這些小分子涉及的代謝途徑相關(guān)酶,也有潛力在報(bào)告基因的基礎(chǔ)上建立胞內(nèi)篩選體系。核糖開關(guān)是一段特殊的RNA序列,可在小分子的誘導(dǎo)下發(fā)生二級結(jié)構(gòu)的改變,這類小分子同樣可以關(guān)聯(lián)到特定的代謝途徑,以核糖開關(guān)下游的報(bào)告基因的表達(dá)情況指示途徑中酶的性能變化(圖1c3、圖1c4)。
圖2. RNA適配體
(圖片來自:doi: 10.1016/j.saa.2022.121760.)
圖3. FRET定量檢測DNA
(圖片來自:doi: 10.1021/acssynbio.9b00103.)
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鎂孚泰生物
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鎂孚泰生物(Molefuture)是翌圣生物科技(上海)股份有限公司旗下的全資子公司,是一家以酶進(jìn)化技術(shù)為驅(qū)動(dòng)、專注于提供酶改造定制化解決方案服務(wù)的創(chuàng)新型企業(yè)。依托于翌圣生物,鎂孚泰生物目前已有六大技術(shù)平臺:ZymeEditor酶改造平臺、多宿主高效表達(dá)平臺、發(fā)酵工藝開發(fā)平臺、純化工藝開發(fā)平臺、超潔凈生產(chǎn)平臺以及分析與質(zhì)控平臺。基于這六大技術(shù)平臺,鎂孚泰生物可提供新酶改造,發(fā)酵與純化工藝優(yōu)化、酶檢測方法開發(fā)、規(guī)?;a(chǎn)的全套定制解決方案!
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