干貨 | 酶定向進(jìn)化之突變體文庫篩選技術(shù)大全

2024-04-03 14:01 Molefuture


上期,我們介紹了酶定向進(jìn)化的突變體文庫構(gòu)建技術(shù)(點擊查看詳情)。高質(zhì)量的突變體文庫是定向進(jìn)化的基礎(chǔ),與之相匹配的是高效、靈敏的突變體篩選技術(shù)手段。根據(jù)突變體酶參與反應(yīng)的場所來區(qū)分,篩選技術(shù)可分為體內(nèi)和體外篩選,篩選的通量和準(zhǔn)確度正隨著技術(shù)的不斷升級而提升。







體內(nèi)篩選





最傳統(tǒng)的體內(nèi)篩選是由菌株篩選衍生而來,目標(biāo)酶活性與菌株生長、環(huán)境中底物代謝程度相關(guān),性能缺陷的酶不足以支撐宿主形成單克隆,或無法使底物發(fā)生顯著變化。該方法適用于篩選與細(xì)菌生長、抗生素耐受等關(guān)鍵代謝途徑相關(guān)的酶,或可使底物發(fā)生顯著顏色變化的蛋白。不過,由于微生物可調(diào)整自身代謝流以適應(yīng)環(huán)境,且存在多種補(bǔ)償途徑,菌株表現(xiàn)的優(yōu)勢可能并非僅僅是目標(biāo)酶的貢獻(xiàn)。

2011年,David Liu團(tuán)隊開發(fā)了PACE系統(tǒng)(噬菌體輔助連續(xù)進(jìn)化,Phage-assisted continuous evolution)用于T7 RNA聚合酶的馴化。PACE以M13絲狀噬菌體為載體,將目標(biāo)酶的活性與子代噬菌體的數(shù)量相關(guān)聯(lián)。其設(shè)計原理如圖1b所示,T7 RNA聚合酶基因取代了噬菌體的衣殼蛋白基因gIII,并受gIII的啟動子控制,gIII基因則安裝在輔助質(zhì)粒上,受T7啟動子控制。重組噬菌體侵染宿主后gIII啟動子開放,T7 RNA聚合酶水平上升,進(jìn)而介導(dǎo)GIII蛋白大量表達(dá),T7 RNA聚合酶基因被包裝在子代噬菌體內(nèi)。聚合酶活性越高,產(chǎn)生的活性子代噬菌體顆粒越多,相應(yīng)突變體序列便隨代次增加而逐漸富集。不僅如此,PACE系統(tǒng)還包含了誘變質(zhì)粒MP(Mutagenesis plasmid),多個誘變基因在L-阿拉伯糖的誘導(dǎo)下,介導(dǎo)包含目的基因在內(nèi)的全基因組范圍的堿基突變。在連續(xù)流加培養(yǎng)體系中,基因組上積累了突變的大腸桿菌不斷被新鮮的細(xì)胞稀釋取代,用來給子代噬菌體提供優(yōu)質(zhì)的宿主,而攜帶突變的噬菌體持續(xù)侵染并疊加新的突變,實現(xiàn)目的基因的連續(xù)篩選和進(jìn)化(圖1a)。利用PACE系統(tǒng),項目組成功地馴化了可以識別T3啟動子的T7 RNA聚合酶突變體。


圖1. PACE進(jìn)化系統(tǒng)

(圖片源自:doi: 10.1038/s41596-020-00410-3.)


PACE系統(tǒng)憑借快速、自動化的優(yōu)勢被迅速推廣,適用于RNA聚合酶、蛋白酶、tRNA合成酶等酶的進(jìn)化,以及一些與DNA、蛋白相互作用的蛋白質(zhì)的篩選(圖1c)。同時,在GIII的拮抗蛋白GIII-neg的輔助下,PACE系統(tǒng)可以更靈活地用于提升多種酶的不同性能(圖1d)。盡管如此,那些無法關(guān)聯(lián)到gIII或其他噬菌體基因表達(dá)過程的蛋白依然難以用PACE系統(tǒng)進(jìn)行篩選,并且所有會導(dǎo)致大腸桿菌生長異常的選擇壓力都難以應(yīng)用。






體外篩選





不同于體內(nèi)篩選,體外篩選需要用溶菌酶、超聲破碎手段或采用分泌表達(dá)策略,使目的蛋白釋放并與底物反應(yīng),借助可檢測的底物、產(chǎn)物量的變化或體系物理、化學(xué)性質(zhì)的變化來挑選目的突變體。傳統(tǒng)體外篩選以試管、多孔板為培養(yǎng)容器,突變體酶經(jīng)分離、純化、濃縮,再進(jìn)行性能評價??装搴Y選的優(yōu)點在于測試準(zhǔn)確、重復(fù)性好,在高通量純化技術(shù)和全自動取樣機(jī)器人的加持下,測試通量也在不斷增加,孔板篩選可用于隨機(jī)文庫和飽和突變文庫的篩選。
除了常規(guī)的試管或孔板篩選外,細(xì)胞直徑大小的油包水液滴也是將不同突變體分隔開的工具。這種策略最早在1998年被應(yīng)用在甲基轉(zhuǎn)移酶的篩選測試中,每條DNA分子和蛋白表達(dá)所需的緩沖液被包裹在單一的液滴內(nèi),表達(dá)后有活性的甲基轉(zhuǎn)移酶可以修飾DNA使之免受內(nèi)切酶的切割,確保生物素標(biāo)簽被完整地保留在3’末端,進(jìn)而可以被純化富集。甲基轉(zhuǎn)移酶最終在10^7的模擬文庫中脫穎而出(圖2)。


圖2. HaeIII甲基轉(zhuǎn)移酶的篩選

(圖片源自:doi: org/10.1038/nbt0798-652.)


受上述系統(tǒng)啟發(fā),一種為DNA聚合酶量身打造的CSR(Compartmentalized Self-Replication)系統(tǒng)被開發(fā)。大腸桿菌取代了無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),負(fù)責(zé)表達(dá)聚合酶并提供DNA模板,液滴內(nèi)添加了PCR所需的緩沖液、dNTP和引物,引物用來擴(kuò)增突變體的編碼區(qū)域。高溫使細(xì)胞破碎,耐熱DNA聚合酶被釋放進(jìn)而完成PCR反應(yīng)。DNA聚合酶的活性越高,相應(yīng)突變體的DNA序列越多,子代文庫中包含該突變體的克隆也就越多,最終形成顯著的數(shù)量優(yōu)勢(圖3)。CSR已被用于Taq、pfu、KOD、Bst等DNA聚合酶,以及一些可與DNA聚合酶表達(dá)關(guān)聯(lián)的蛋白(如T7 RNA聚合酶、tRNA合成酶、tRNA)的進(jìn)化,但它在其他酶種的進(jìn)化中難以滿足需求。


圖3. 分隔自復(fù)制系統(tǒng)

(圖片源自:doi: 10.1073/pnas.071052198.)


酶的定向進(jìn)化除了類似PACE、CSR這種通過積累數(shù)量實現(xiàn)優(yōu)勢突變體富集的方法外,還可以采用突變體分選的策略。

以流式分選技術(shù)為例,只要酶性能與細(xì)胞的大小、形狀、熒光強(qiáng)度或表面修飾狀態(tài)相關(guān)聯(lián),當(dāng)細(xì)胞流經(jīng)監(jiān)測口時儀器就能采集相關(guān)信號并借助電荷和磁場的作用,實現(xiàn)目標(biāo)細(xì)胞的分選。而適用于微米級微生物分選的FADS(Fluorescence-Activated Droplet Sorting)及其衍生系統(tǒng)(AADS、BADS、MADS)則是另一種技術(shù),為流式分選和液滴技術(shù)的結(jié)合。微生物細(xì)胞和底物分散在反應(yīng)緩沖液中作為水相流入PDMS芯片中,油相則從垂直方向進(jìn)入,通過調(diào)整兩種液體的流速,水相被均勻地分割為20-50 μm大小的液滴。不同于耐熱的CSR體系,液滴分選系統(tǒng)的細(xì)胞破碎只能依賴溶菌酶或其他化學(xué)試劑。為了防止細(xì)胞在進(jìn)入液滴前裂解,溶菌試劑推薦使用再注入的方法輸入液滴,或使用替代方案先將溶菌組分與細(xì)胞混合,再將反應(yīng)底物注入液滴。隨后液滴在合適條件下脫機(jī)孵育,催化反應(yīng)將使液滴內(nèi)的濁度、pH值、熒光信號強(qiáng)度、特征化合物的量發(fā)生顯著變化,超過設(shè)定閾值的液滴將在電場或氣流的作用下發(fā)生偏轉(zhuǎn),流入收集管內(nèi)(圖4)。收集的完整細(xì)胞可直接涂布培養(yǎng),破碎的細(xì)胞則只能擴(kuò)增回收DNA用于后續(xù)實驗。


圖4. 液滴分選

(圖片源自:doi: 10.1016/j.tibs.2021.11.001.)


液滴分選系統(tǒng)具有以下優(yōu)勢直接檢測產(chǎn)物,可準(zhǔn)確反應(yīng)酶學(xué)性能的變化;皮升級的液滴反應(yīng)器可大幅度節(jié)約試劑成本(~10^6倍);最多可實現(xiàn)10^8/day的液滴分選;可通過設(shè)計芯片結(jié)構(gòu)、調(diào)整模塊組合來適配多種酶的篩選場景。

超高通量篩選技術(shù)的出現(xiàn)極大地提高了酶定向進(jìn)化的效率,滿足大體量突變體文庫的篩選需求。尤其是以液滴為基礎(chǔ)的體外篩選技術(shù),進(jìn)一步縮短了酶的迭代周期,可迅速填補(bǔ)特殊應(yīng)用場景下酶性能的缺陷,推動現(xiàn)代生命科學(xué)和工業(yè)應(yīng)用的發(fā)展。


針對以上介紹的不同突變體文庫篩選方法總結(jié)如下表,實際可根據(jù)不同需求選擇。

篩選場所

篩選方法

實現(xiàn)篩選方式

篩選特點

體內(nèi)

單克隆篩選

生存優(yōu)勢-富集,產(chǎn)物優(yōu)勢-分離

  • 關(guān)聯(lián)微生物生長或蛋白表達(dá)

  • 篩選壓力溫和

  • 優(yōu)勢突變體宿主可繁殖

  • 宿主的途徑進(jìn)化干擾篩選

PACE(PANCE)

生存優(yōu)勢-富集

體外

孔板篩選

性能優(yōu)勢-分離

  • 精度高,重復(fù)性好

  • 通量較低

  • 應(yīng)用廣泛

CSR(CPR, iCSR等)

產(chǎn)量優(yōu)勢-富集

  • 操作便捷

  • 通量高

FADS(FACS, AADS, BADS, MADS等)

性能優(yōu)勢-分選

  • 應(yīng)用廣泛

  • 通量高

  • 靈敏度低


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