體內(nèi)篩選
最傳統(tǒng)的體內(nèi)篩選是由菌株篩選衍生而來,目標(biāo)酶活性與菌株生長、環(huán)境中底物代謝程度相關(guān),性能缺陷的酶不足以支撐宿主形成單克隆,或無法使底物發(fā)生顯著變化。該方法適用于篩選與細(xì)菌生長、抗生素耐受等關(guān)鍵代謝途徑相關(guān)的酶,或可使底物發(fā)生顯著顏色變化的蛋白。不過,由于微生物可調(diào)整自身代謝流以適應(yīng)環(huán)境,且存在多種補(bǔ)償途徑,菌株表現(xiàn)的優(yōu)勢可能并非僅僅是目標(biāo)酶的貢獻(xiàn)。
2011年,David Liu團(tuán)隊開發(fā)了PACE系統(tǒng)(噬菌體輔助連續(xù)進(jìn)化,Phage-assisted continuous evolution)用于T7 RNA聚合酶的馴化。PACE以M13絲狀噬菌體為載體,將目標(biāo)酶的活性與子代噬菌體的數(shù)量相關(guān)聯(lián)。其設(shè)計原理如圖1b所示,T7 RNA聚合酶基因取代了噬菌體的衣殼蛋白基因gIII,并受gIII的啟動子控制,gIII基因則安裝在輔助質(zhì)粒上,受T7啟動子控制。重組噬菌體侵染宿主后gIII啟動子開放,T7 RNA聚合酶水平上升,進(jìn)而介導(dǎo)GIII蛋白大量表達(dá),T7 RNA聚合酶基因被包裝在子代噬菌體內(nèi)。聚合酶活性越高,產(chǎn)生的活性子代噬菌體顆粒越多,相應(yīng)突變體序列便隨代次增加而逐漸富集。不僅如此,PACE系統(tǒng)還包含了誘變質(zhì)粒MP(Mutagenesis plasmid),多個誘變基因在L-阿拉伯糖的誘導(dǎo)下,介導(dǎo)包含目的基因在內(nèi)的全基因組范圍的堿基突變。在連續(xù)流加培養(yǎng)體系中,基因組上積累了突變的大腸桿菌不斷被新鮮的細(xì)胞稀釋取代,用來給子代噬菌體提供優(yōu)質(zhì)的宿主,而攜帶突變的噬菌體持續(xù)侵染并疊加新的突變,實現(xiàn)目的基因的連續(xù)篩選和進(jìn)化(圖1a)。利用PACE系統(tǒng),項目組成功地馴化了可以識別T3啟動子的T7 RNA聚合酶突變體。
圖1. PACE進(jìn)化系統(tǒng)
(圖片源自:doi: 10.1038/s41596-020-00410-3.)
PACE系統(tǒng)憑借快速、自動化的優(yōu)勢被迅速推廣,適用于RNA聚合酶、蛋白酶、tRNA合成酶等酶的進(jìn)化,以及一些與DNA、蛋白相互作用的蛋白質(zhì)的篩選(圖1c)。同時,在GIII的拮抗蛋白GIII-neg的輔助下,PACE系統(tǒng)可以更靈活地用于提升多種酶的不同性能(圖1d)。盡管如此,那些無法關(guān)聯(lián)到gIII或其他噬菌體基因表達(dá)過程的蛋白依然難以用PACE系統(tǒng)進(jìn)行篩選,并且所有會導(dǎo)致大腸桿菌生長異常的選擇壓力都難以應(yīng)用。
體外篩選
圖2. HaeIII甲基轉(zhuǎn)移酶的篩選
(圖片源自:doi: org/10.1038/nbt0798-652.)
圖3. 分隔自復(fù)制系統(tǒng)
(圖片源自:doi: 10.1073/pnas.071052198.)
以流式分選技術(shù)為例,只要酶性能與細(xì)胞的大小、形狀、熒光強(qiáng)度或表面修飾狀態(tài)相關(guān)聯(lián),當(dāng)細(xì)胞流經(jīng)監(jiān)測口時儀器就能采集相關(guān)信號并借助電荷和磁場的作用,實現(xiàn)目標(biāo)細(xì)胞的分選。而適用于微米級微生物分選的FADS(Fluorescence-Activated Droplet Sorting)及其衍生系統(tǒng)(AADS、BADS、MADS)則是另一種技術(shù),為流式分選和液滴技術(shù)的結(jié)合。微生物細(xì)胞和底物分散在反應(yīng)緩沖液中作為水相流入PDMS芯片中,油相則從垂直方向進(jìn)入,通過調(diào)整兩種液體的流速,水相被均勻地分割為20-50 μm大小的液滴。不同于耐熱的CSR體系,液滴分選系統(tǒng)的細(xì)胞破碎只能依賴溶菌酶或其他化學(xué)試劑。為了防止細(xì)胞在進(jìn)入液滴前裂解,溶菌試劑推薦使用再注入的方法輸入液滴,或使用替代方案先將溶菌組分與細(xì)胞混合,再將反應(yīng)底物注入液滴。隨后液滴在合適條件下脫機(jī)孵育,催化反應(yīng)將使液滴內(nèi)的濁度、pH值、熒光信號強(qiáng)度、特征化合物的量發(fā)生顯著變化,超過設(shè)定閾值的液滴將在電場或氣流的作用下發(fā)生偏轉(zhuǎn),流入收集管內(nèi)(圖4)。收集的完整細(xì)胞可直接涂布培養(yǎng),破碎的細(xì)胞則只能擴(kuò)增回收DNA用于后續(xù)實驗。
圖4. 液滴分選
(圖片源自:doi: 10.1016/j.tibs.2021.11.001.)
液滴分選系統(tǒng)具有以下優(yōu)勢:直接檢測產(chǎn)物,可準(zhǔn)確反應(yīng)酶學(xué)性能的變化;皮升級的液滴反應(yīng)器可大幅度節(jié)約試劑成本(~10^6倍);最多可實現(xiàn)10^8/day的液滴分選;可通過設(shè)計芯片結(jié)構(gòu)、調(diào)整模塊組合來適配多種酶的篩選場景。
針對以上介紹的不同突變體文庫篩選方法總結(jié)如下表,實際可根據(jù)不同需求選擇。
篩選場所 | 篩選方法 | 實現(xiàn)篩選方式 | 篩選特點 |
體內(nèi) | 單克隆篩選 | 生存優(yōu)勢-富集,產(chǎn)物優(yōu)勢-分離 |
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PACE(PANCE) | 生存優(yōu)勢-富集 | ||
體外 | 孔板篩選 | 性能優(yōu)勢-分離 |
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CSR(CPR, iCSR等) | 產(chǎn)量優(yōu)勢-富集 |
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FADS(FACS, AADS, BADS, MADS等) | 性能優(yōu)勢-分選 |
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