mRNA技術作為一種新興的生物技術,具有巨大的應用潛力。從 mRNA 疫苗到 mRNA 藥物,這一技術為疾病的預防和治療提供了全新的思路。然而,mRNA 技術的發(fā)展并非一帆風順,其中最大的挑戰(zhàn)之一便是副產(chǎn)物雙鏈 RNA(dsRNA)的形成。dsRNA 作為一種免疫刺激分子,會引發(fā)機體的免疫反應,從而影響 mRNA 的安全性和有效性。因此,如何減少 dsRNA 的形成,成為 mRNA 技術領域亟待解決的關鍵問題。
傳統(tǒng)解決方案依賴繁瑣的純化工藝,但成本高、效率低,且難以徹底清除微量dsRNA。作為mRNA體外轉錄(IVT)的核心工具酶,T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)的天然活性(如末端轉移酶和RNA依賴的RNA聚合酶活性)被認為是dsRNA形成的關鍵因素,如何通過定向進化或理性設計改造T7 RNAP,成為全球科研團隊競逐的焦點。
2024年3月3日,我們團隊在FEBS Journal發(fā)表題為Engineered T7 RNA polymerase reduces dsRNA formation by lowering terminal transferase and RNA-dependent RNA polymerase activities的研究論文。團隊成功通過工程化改造T7 RNAP,顯著降低體外轉錄過程中dsRNA的生成(僅為野生型的1.8%),且大幅度提升了合成mRNA的整體效率和質(zhì)量,推動了基因治療、疫苗開發(fā)領域的跨越式發(fā)展。
我們創(chuàng)新性的通過結合定向進化和半理性設計的方法,成功篩選出多個高效低毒的T7 RNAP突變體,這些突變體在減少dsRNA形成方面表現(xiàn)出色。
我們構建了隨機突變庫,設計了一種可實時監(jiān)測液滴內(nèi)RNA產(chǎn)物的完整性與dsRNA含量的分子信標探針系統(tǒng),利用熒光激活液滴分選(FADS)定向進化技術進行超高通量篩選。最終篩選出關鍵候選突變體Mut1(V214A)、Mut7(F162S/A247T)產(chǎn)生的dsRNA含量顯著低于野生型。
同時,團隊通過半理性設計方法,構建了十個單點飽和突變庫,并利用微孔板篩選技術來識別有益的突變體。其中,微孔板篩選使用了雙探針,增加的5’-end探針用于檢測RNA產(chǎn)量。在篩選超過1000個突變體后,發(fā)現(xiàn)了關鍵候選突變體Mut11 (K180E)、Mut14 (A70Q)產(chǎn)生的dsRNA含量顯著低于野生型,并且未影響轉錄效率。
為了進一步優(yōu)化,團隊針對上述突變位點構建了DNA shuffling文庫,通過微孔板篩選,最終獲得組合突變體M17(A70Q/F162S/K180E)。實驗顯示,M17的dsRNA含量僅為野生型的1.8%,在篩選體系中僅為0.007 ng/μg。
這一結果不僅在體外實驗中得到了驗證,還在細胞實驗中表現(xiàn)出顯著的免疫原性降低和蛋白翻譯效率提升。團隊將突變體轉錄的mRNA導入RAW264.7細胞后,最優(yōu)突變體M11產(chǎn)物引發(fā)的干擾素β(IFN-β)的mRNA和蛋白表達量僅為野生型的9.7%和12.93 pg/mL。在HEK293細胞中,突變體mRNA的EGFP表達細胞數(shù)顯著增加,且熒光強度穩(wěn)定。這表明,減少dsRNA可有效解除PKR介導的翻譯抑制,釋放mRNA治療潛力。
為了深入了解突變體降低dsRNA的作用機制,團隊通過計算機模擬與功能實驗,揭示了突變體是由于降低了RNA依賴的RNA聚合酶(RDRP)活性和末端轉移酶活性而導致dsRNA的降低,這一發(fā)現(xiàn)為未來進一步優(yōu)化 T7 RNAP提供了重要的理論依據(jù)。
本研究為T7 RNAP的改造提供了新的方法與思路,也為 mRNA 技術的發(fā)展注入了新活力。通過減少dsRNA的形成,提升了 mRNA 的質(zhì)量和安全性。
憑借此項研究成果,我們成功推出了一款大幅降低 dsRNA 含量的GMP級別的T7 RNAP產(chǎn)品(Cat#10629,Cleascrip T7 RNA Polymerase GMP-grade (low dsRNA, 250 U/μL))。該產(chǎn)品在 mRNA 疫苗、mRNA 藥物等領域展現(xiàn)出廣泛的應用潛力,有望進一步推動 mRNA 技術的蓬勃發(fā)展,為生物醫(yī)學領域帶來更多的可能性。
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