重磅 | 3大策略：如何通過優(yōu)化T7 RNA聚合酶提升mRNA藥物安全性？

mRNA技術作為一種新興的生物技術，具有巨大的應用潛力。從 mRNA 疫苗到 mRNA 藥物，這一技術為疾病的預防和治療提供了全新的思路。然而，mRNA 技術的發(fā)展并非一帆風順，其中最大的挑戰(zhàn)之一便是副產(chǎn)物雙鏈 RNA（dsRNA）的形成。dsRNA 作為一種免疫刺激分子，會引發(fā)機體的免疫反應，從而影響 mRNA 的安全性和有效性。因此，如何減少 dsRNA 的形成，成為 mRNA 技術領域亟待解決的關鍵問題。

傳統(tǒng)解決方案依賴繁瑣的純化工藝，但成本高、效率低，且難以徹底清除微量dsRNA。作為mRNA體外轉錄（IVT）的核心工具酶，T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）的天然活性（如末端轉移酶和RNA依賴的RNA聚合酶活性）被認為是dsRNA形成的關鍵因素，如何通過定向進化或理性設計改造T7 RNAP，成為全球科研團隊競逐的焦點。

我們創(chuàng)新性的通過結合定向進化和半理性設計的方法，成功篩選出多個高效低毒的T7 RNAP突變體，這些突變體在減少dsRNA形成方面表現(xiàn)出色。

我們構建了隨機突變庫，設計了一種可實時監(jiān)測液滴內(nèi)RNA產(chǎn)物的完整性與dsRNA含量的分子信標探針系統(tǒng)，利用熒光激活液滴分選（FADS）定向進化技術進行超高通量篩選。最終篩選出關鍵候選突變體Mut1（V214A）、Mut7（F162S/A247T）產(chǎn)生的dsRNA含量顯著低于野生型。

同時，團隊通過半理性設計方法，構建了十個單點飽和突變庫，并利用微孔板篩選技術來識別有益的突變體。其中，微孔板篩選使用了雙探針，增加的5’-end探針用于檢測RNA產(chǎn)量。在篩選超過1000個突變體后，發(fā)現(xiàn)了關鍵候選突變體Mut11 (K180E)、Mut14 (A70Q)產(chǎn)生的dsRNA含量顯著低于野生型，并且未影響轉錄效率。

為了進一步優(yōu)化，團隊針對上述突變位點構建了DNA shuffling文庫，通過微孔板篩選，最終獲得組合突變體M17（A70Q/F162S/K180E）。實驗顯示，M17的dsRNA含量僅為野生型的1.8%，在篩選體系中僅為0.007 ng/μg。

這一結果不僅在體外實驗中得到了驗證，還在細胞實驗中表現(xiàn)出顯著的免疫原性降低和蛋白翻譯效率提升。團隊將突變體轉錄的mRNA導入RAW264.7細胞后，最優(yōu)突變體M11產(chǎn)物引發(fā)的干擾素β（IFN-β）的mRNA和蛋白表達量僅為野生型的9.7%和12.93 pg/mL。在HEK293細胞中，突變體mRNA的EGFP表達細胞數(shù)顯著增加，且熒光強度穩(wěn)定。這表明，減少dsRNA可有效解除PKR介導的翻譯抑制，釋放mRNA治療潛力。

為了深入了解突變體降低dsRNA的作用機制，團隊通過計算機模擬與功能實驗，揭示了突變體是由于降低了RNA依賴的RNA聚合酶（RDRP）活性和末端轉移酶活性而導致dsRNA的降低，這一發(fā)現(xiàn)為未來進一步優(yōu)化 T7 RNAP提供了重要的理論依據(jù)。

本研究為T7 RNAP的改造提供了新的方法與思路，也為 mRNA 技術的發(fā)展注入了新活力。通過減少dsRNA的形成，提升了 mRNA 的質(zhì)量和安全性。